研究人员系统绘制了病人、食蟹猴、巴马猪、小鼠NASH模型的肝脏转录组图谱（图1A），发现花生四烯酸代谢通路相关基因，特别是ALOX12在NASH中显著激活，且与NASH的严重程度密切相关（图1B），通过基因敲除和过表达等系列实验证明ALOX12可以显著加剧肝脏脂肪堆积、炎症、纤维化等NASH进程。

重要的是研究者通过CO-IP+质谱的手段筛选了ALOX12的互作蛋白（图2A），结合小鼠和巴马猪ALOX12敲除后的蛋白质组学结果，发现8个质谱鉴定到的互作蛋白在上述组学中也有显著差异，说明了与ALOX12密切相关，其中包括ACC1蛋白（图B、C)。随后的CO-IP验证了ALOX12可特异性结合ACC1（图2D），且WB结果也显示敲除或干扰ALOX12可以下调ACC1蛋白表达（图2E）。

最后，研究人员，通过CO-IP+质谱的手段筛选了与ALOX12和ACC1共同作用的蛋白，发现这些蛋白主要为调控溶酶体降解途径的相关蛋白（图3A），且发现敲除或干扰ALOX12能调控溶酶体降解途径，改善小鼠和巴马猪的NASH严重程度， 敲除ACC1能够下调NASH相关指标，抑制ALOX12诱导的NASH进程（图3B）。总之，研究揭示了NASH发生发展的核心机制，即ALOX12可直接靶向ACC1促进NASH进展。

图3.ALOX12结合ACC1调控溶酶体降解途径促进NASH进展

研究人员基于上述的研究结果，开展了以ALOX12为靶点的NASH药物发现研究之旅。已知的ALOX12抑制剂ML355，可有效改善血栓形成、血小板聚集、胰岛功能障碍，但ML355是否影响ALOX12与ACC1的相互作用，改善NASH进展尚不清楚。首先研究人员通过等温滴定量热法（isothermal titration calorimetry，ITC）分析显示了ALOX12和ML355的直接相互作用（图4A），并且与ALOX12敲除的效果一样，ML355处理高脂高胆固醇（HFHC）喂养的小鼠16周后，ACC1在小鼠肝脏中的表达显著下调（图4B），但是小角X射线散射（Small-angle x-ray scattering, SAXS）分析显示了ML355对ALOX12蛋白质构象、ALOX12 与ACC1之间的相互作用并没有显著的影响（图4C、D），并通过CO-IP得到验证（图4E）。这就说明了ML355在体内有效能，但在体外无作用，表明ML355的功能可能是前药的代谢衍生物导致。于是研究人员收集了猕猴血浆静脉注射ML355后不同时间点的样本（图4F），通过Q-TOF质谱仪分析血浆样品，发现ML355的一种主要代谢物是一种葡萄糖醛酸类的物质，将其命名为IMA-1（图4G），通过质谱多反应监测（MRM）技术进行ML355的药代动力学分析表明在猕猴和小鼠血清中的ML355迅速转化为IMA-1，在注射后5min后即可检测到，注射后24小时后循环IMA-1的浓度高于ML355（图4H）。这些结果说明ML355的功能可能依赖于IMA-1。

接下来，研究人员使用 ITC检测发现IMA-1可直接与ALOX12结合（图 5A）。SAXS和CO-IP 测定结果显示IMA-1可以显著阻止ALOX12和ACC1之间的相互作用（图 5B、 C）。接着研究人员使用分子对接技术在ALOX12中确定了一个IMA-1 结合口袋，位于 ALOX12-ACC1 的结合界面附近，并且预测ALOX12的Gln538残基是IMA-1的核心结合位点（图5E），Gln538残基突变为丙氨酸（Q538A）后ALOX12不再结合IMA-1（图 5D、F）。IMA-1处理HFHC喂养的小鼠16周后，ACC1在小鼠肝脏中的表达显著下调（图 5G）。这些结果表明IMA-1 可直接中断ALOX12-ACC1相互作用。

图5.IMA-1可直接中断ALOX12-ACC1相互作用

最后通过系统的药效学评价发现IMA-1可显著抑制小鼠和食蟹猴NASH进展（图6A），抑制脂肪酸合成、趋化因子信号、TNFα信号、TGF-β信号传导和坏死性凋亡等信号通路（图6B），并且IMA-1并不会在小鼠和食蟹猴中引起那些ACC经典酶活抑制剂所导致的高脂血症的副作用（图6C）。在机制研究中，研究人员发ACC1受抑制的程度是决定其是否诱导产生高脂血症的重要原因，传统的ACC抑制剂几乎完全抑制ACC活性，而IMA-1特异性阻断 ALOX12和ACC1互作，促进其溶酶体降解，而不影响其蛋白酶体降解途径（6D）。

图6.IMA-1特异性阻断 ALOX12和ACC1互作促进其溶酶体降解

上述研究是从疾病机制发现到药靶，再到新药发现的一个非常系统的研究案例：第一篇文章通过组学的方法研究NASH的发病机制，找到了关键的功能蛋白ALOX12作为潜在的药物靶点。第二篇文章以已知的靶向ALOX12的小分子药物ML355为突破口，发现ML355体内能够起到改善NASH的作用，但是在体外却不能影响ALOX12蛋白质构象或ALOX12 与ACC1之间的相互作用。于是猜想ML355的功能可能是由体内的代谢衍生物导致的。通过入血成分鉴定和药代动力学分析发现了ML355衍生物葡萄糖醛酸类物质IMA-1是其发挥作用的分子，并发现IMA-1能够阻断ALOX12 与ACC1之间的相互作用进而发挥疗效。

文章中的一些关键点需要我们特别注意：

1）如何发现与NASH的发病密切相关的蛋白ALOX12？由于大多数药靶为蛋白质，因此，蛋白质组学成为发现潜在药靶的经典方法。

2）筛选与ALOX12的互作蛋白ACC1：通过CO-IP/Pull down+质谱或人类20K蛋白芯片的手段是必须途径；

3）鉴定ML355的体内代谢衍生物IMA-1：Q-TOF质谱仪筛选+基于MRM技术的药代动力学分析是不可越过的技术手段；

4）验证IMA-1与ALOX12的相互结合位点：分子对接模拟和SPR技术是最常用的技术。

总之，通过对上述技术手段的充分合理的运用，作者实现了药物开发的目标及其作用机制的研究，呈现了两篇高水平文章，为我们提供了非常好的思路借鉴。

达吉特针对于中药及小分子药物研究，建立了一套完整的技术服务体系：

1）中药/复方的有效成分及代谢产物分离与鉴定

2）血清/组织药代动力学分析

3）小分子化合物生物素批量标记

4)  小分子靶点筛选：20K芯片，CO-IP/Pull down+质谱

5）药物调控信号通路筛选：磷酸化抗体芯片，蛋白质组学

6）网络药理学与计算机分子对接

7）SPR表面等离子共振（分子动力学）

如果对药物靶点-机理研究这一块感兴趣并计划开展相关实验的话，达吉特可为您提供专业的技术服务和解决方案，助力您的药物研究之路。

|   达吉特-为药寻靶

达吉特为上海welcome-球速体育医药科技有限公司旗下品牌，坐落于上海张江高科技园区腹地，是专业开展小分子药物和抗体大分子药物靶点发现与鉴定技术的开发与服务的高科技企业。

达吉特中药复方/小分子药理研究平台的核心团队成员由上海中医药大学、上海交通大学医学院等知名中医药和系统生物学研究团队中的博士和博士后组成。达吉特建立了从中药/复方活性成分鉴定、天然化合物提取到小分子靶点发现与活性验证“一体化”技术体系。不仅能够为中药的深入研究提供了有力支撑，也为小分子药物设计研发、经典药物创新应用等一系列小分子药物研究提供了可靠的技术保障。