​葫芦素B ( cucurbitacin B，CuB ) 是瓜蒂等葫芦科植物中分离得到的一类四环三萜类化合物，是葫芦素家族中含量最丰富的成员，具有保肝、消炎和抗肿瘤等广泛的药理活性。在我国CuB已被用作慢性肝炎和原发性肝癌的辅助治疗剂。虽然已经有很多学者研究了CuB的不同抗癌机制，但大多数都是下游途径和疗效表型，CuB在多种肿瘤中的直接作用靶点至今尚未明确。

2022年10月，华东理工大学药学院李剑教授与上海九院眼科徐晓芳/贾仁兵教授团队合作在Acta Pharm Sin B（IF=14.903）上发表了题为“Cucurbitacin B-induced G2-M cell cycle arrest of conjunctival melanoma cells mediated by GRP78–FOXM1–KIF20A pathway”的研究论文，深入阐明了葫芦素B抑制结膜黑色素瘤直接靶点及作用机制。

前期研究人员利用结膜黑色素瘤（Conjunctival melanoma，CM）细胞株筛选自建的上市老药库（含1400个化药和天然药），发现了一批具有良好抗CM增殖活性的老药。其中，葫芦素B对NRAS和BRAF突变的CM细胞均表现出突出的抗增殖活性。尽管CuB已被研究人员证明可以有效抑制CM细胞增殖作用，但其作用机制及靶点尚不清楚。于是，研究人员利用细胞实验研究发现CuB抑制CM细胞增殖并导致G2/M细胞周期停滞（图1A），并通过RNA-Seq、qPCR和Western blot发现CuB抑制CM细胞FOXM1/PLK1 -KIF20A通路（图1B、C）。

图1 CuB抑制CM细胞增殖

为了识别CuB的直接靶蛋白，研究人员采用ABPP（Activity-Based Protein Profiling）的化学蛋白质组学策略（图2A），合成了5种探针（图2B），并评估了探针的活性，发现BP-2抑制CRMM2细胞生长的IC50与CuB相当，BP-4无抗癌活性，因此BP-2被用作活性探针（active probe），BP-4被用作阴性探针（negative probe）。接着用不同的探针原位进行“点击”反应来标记整个蛋白质组，在细胞裂解前，CRMM2细胞用0.2 μmol/L的不同探针处理3小时。细胞裂解物在CuAAC介导的点击反应下与TAMRA-叠氮化物反应，并通过SDS-PAGE分离。凝胶内荧光扫描表明这些探针可以标记不同的细胞靶点（图2C）。与阴性探针BP-4相比，活性探针BP-2导致的可见条带更多、更强，而BP-1、-3和-5给出了其他可见光带，这种差异可归因于不同的修饰位点或不同的细胞活动。用BP-2标记的蛋白质在细胞裂解物中也显示出剂量依赖性（图2D），表明可以通过pulldown/银染实验进一步挖掘特定的靶蛋白。

图2 CuB探针设计及评估

为了识别BP-2的潜在细胞靶标，研究采用了基于Pulldown/LC-MS/MS进行靶标识别。样品与TAMRA–Biotin–N3偶联，用链霉亲和素小量制备柱进行亲和富集，并使用SDS-PAGE分离。银染显示~75 kDa位置的蛋白质在BP-2处理组中富集，但在BP-4和CuB竞争组中减少（图 3A），这一结果表明这些条带可能是探针靶向蛋白，而不是大量的非特异性标记（图3B）。LC-MS/MS分析发现了一批结合蛋白，见列表（图3C），在符合标准（intensity: negative = 0, BP-2 > CuB）的九种蛋白质中，78kDa的葡萄糖调节蛋白 (GRP78) 是PLK1的上游调节剂，且GRP78已被验证为多种癌症的潜在生物标志物和治疗靶点，可抑制癌细胞的进展、增殖、侵袭和转移，故使用相应的抗体进一步Pulldown/WB分析将GRP78蛋白鉴定为潜在靶标（图3B）。

图3 基于ABPP的CuB靶点筛选

研究进一步通过多种实验进行了靶标的验证。首先通过WB发现BP-2能够以剂量依赖性方式成功标记重组GRP78，并且BP-2的荧光强度与所鉴定蛋白质的量相关，表明探针BP-2对GRP78蛋白具有极好的敏感性（图4A），随后通过热位移（TSA）（图4B）、微型热泳（MST）（图4C）进行了验证，并通过质谱发现在经过CuB处理的重组GRP78样品中，GRP78的Lys326位点存在α-β-不饱和酮修饰（CuB 结构中存在α-β-不饱和酮部分可能作为与其靶标共价结合的反应基团起作用）（图4D）。这些结果表明CuB与GRP78相互作用并通过α-β-不饱和酮部分。

图4葫芦素B靶点验证

通过Rescue实验发现GRP78敲低削弱了CuB抑制细胞增殖的作用，而GRP78过表达强化了CuB抑制细胞增殖的作用（图5A），此外，GRP78敲低显著降低多种结膜黑色素瘤细胞中 FOXM1、PLK1、KIF20A和细胞周期蛋白B1-CDK1复合物的表达（图5B）。

图4 CuB通过靶点发挥功能

总之，CuB通过结合GRP78抑制GRP78-FOXM1-KIF20A通路进而抑制CM细胞周期发挥功能。

此外，近期有两篇CuB在肝癌和肺癌中的直接作用靶点的文章值得关注，在此做了简要描述：

综上，越来越多的中药活性成分被发现在多种疾病中发挥药理活性，发现其在不同疾病中的不同的直接作用靶点将有助于深入挖掘其作用机制。近年来筛选并验证中药活性成分的直接靶点的技术手段越来越多，且各具特色，这将极大的推动中药现代化研究进程。

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