在今年二月份公布的“2022年度中医药十大学术进展”中，靶点“钩钓”等新技术助力中药功效科学内涵阐释被重点提及，其中提到，北京大学医学部曾克武教授和屠鹏飞教授团队以中药药效成分为工具探针，通过靶点“钩钓”技术系统揭示了蟾酥、五味子、野马追等中药代表性成分的直接靶点蛋白及参与疾病相关进程的分子生物学机制，为“清热解毒、补肾宁心、消肿利湿”等中药功效提供了微观证据，同时也提出了具备自主知识产权的免疫炎症、肿瘤、神经退行等重大疾病治疗新靶点，研究论文2022年发表于Sci. Adv、EbioMedicine、APSB等。

近日，北京大学医学部曾克武&屠鹏飞教授团队又发表2篇高水平的文章：

2023年3月，该团队在Small（IF=15.153）发表题为“Inherent Capability of Self-Assembling Nanostructures in Specific Proteasome Activation for Cancer Cell Pyroptosis”的文章，揭示齐墩果酸（OA）自组装纳米胶束通过直接结合20S蛋白酶体亚基（PSMA6）激活细胞蛋白酶体功能； 

2023年4月，该团队在Advanced Science（IF=17.521）发表题为“Allosteric Activation of Transglutaminase 2 via Inducing an “Open” Conformation for Osteoblast Differentiation”的文章，揭示毛喉素（forskolin）通过直接靶向转谷氨酰胺酶 2（TGM2）诱导成骨细胞分化进而改善骨质疏松症；

了解纳米结构本身与生物系统的直接相互作用对于生物医学应用很重要。天然小分子可基于其自身特殊结构自发组装成纳米微粒。但长期以来，这些聚集体的起效方式并未引起业内关注，其特定的作用靶点有待深入探究。该团队前期从天然产物库和天然产物衍生物库中筛选了2181种天然化合物的自组装能力，发现具有抗肿瘤活性的天然产物齐墩果酸可以在水溶液中形成稳定的纳米胶束（OA NMs），但形成OA NMs后其药理活性及潜在机制尚不清楚，考虑到蛋白酶体是所有真核生物中重要的蛋白质复合物，在决定细胞命运的蛋白质降解途径中起着核心作用，OA NMs是否也能调节蛋白酶体活性并发挥抗肿瘤作用尚不清楚。

首先，研究通过“加热-分散”的策略制备出齐墩果酸纳米胶束（OA NMs）并进行表征，证实OA化合物通过分子间非共价键自发聚集成纳米胶束（图1A）。通过活性筛选发现OA NMs具有显著的激活蛋白酶体的功能（图1B），且OA NMs有显著的杀伤肿瘤细胞作用（图1C），诱导肿瘤细胞U2OS发生焦亡（图1D）。两种蛋白酶体抑制剂均明显逆转了OA NMs对细胞活力的抑制（图1E），表明OA NMs可能通过靶向蛋白酶体而诱导细胞焦亡。

图1齐墩果纳米胶束促进蛋白酶体活性

通过热蛋白组分析技术（TPP）（图2A）进一步鉴定到该纳米胶束与肿瘤细胞中的20S蛋白酶体蛋白α环亚基6（PSMA6）存在直接作用（图2B），表明PSMA6是OA纳米胶束的直接细胞靶点。进一步通过MST（图2C）、SPR（图2D）、CETSA（图2E）、DARTS（图2F）、免疫荧光共定位（图2G）、pulldown+WB（图2H、2I）证实了PSMA6与OA NMs的直接结合。进一步使用氢氘交换（HDX-MS）等手段，挖掘到OA NMs能够使得PSMA6的N端结构域发生变构。通过DARTS-MS来确定PSMA6的结合片段，定量分析结果表明OA纳米胶束可能通过选择性靶向PSMA6中的165-181区域，动态地改变了PSMA6的构象，以控制底物进入20S蛋白酶体进行降解。

图2 齐墩果纳米胶束的直接作用靶点

接下来，为了研究OA NMs激活蛋白酶体后如何诱导细胞焦亡，研究通过全蛋白组学分析（图3A）发现OA NMs处理后使得细胞内大量的蛋白，包括维持肿瘤细胞生存的蛋白、抑制细胞死亡蛋白被明显下调（图3B）。其中PLIN2和UBE4B被鉴定为两个诱导细胞下游焦亡通路激活的关键蛋白（图3C）。最后，该研究在荷瘤小鼠上，进一步验证了OA NMs的体内抗肿瘤疗效（图3D）。

图3 齐墩果纳米胶束通过靶点发挥作用

总之，在这项研究中发现齐墩果酸天然自组装纳米胶束直接结合PSMA6来激活蛋白酶体功能，进而诱导肿瘤细胞焦亡（图3E）。这一发现拓宽了目前对纳米材料在生物医学领域应用的理解，特别为开发选择性靶向细胞中关键生物分子的新型纳米药物提供了概念验证。

成骨细胞介导的骨形成是骨代谢中的重要一环，骨代谢异常能够导致骨质疏松等骨病的发生。毛喉素（forskolin）传统药用植物毛喉鞘蕊花（Coleus forskohlii）的代表性活性成分。作为一种天然二萜类化合物，具有一定的促成骨分化的作用，但其直接靶点和分子机制还不清楚，阐明毛喉素促成骨分化的药理机制对于抗骨质疏松药物的开发具有重要的意义。该团队通过合成毛喉素探针，鉴定了毛喉素在小鼠成骨细胞中的直接靶点为谷氨酰胺转移酶2（TGM2），并发现毛喉素对于TGM2具有新颖的变构激活机制。

研究首先通过小鼠前成骨细胞MC3T3-E1和原代成骨细胞中ALP活性（图4A、B）、矿化结节数量（图4C、D）以及成骨相关基因表达的检测验证了毛喉素具有良好的体外促成骨分化作用。

图4毛喉素诱导成骨细胞分化

进一步合成具有光交联反应功能和Click反应接口的毛喉素探针（图5A），利用该探针开展ABPP分析，发现TGM2是毛喉素在MC3T3-E1细胞中结合特异性最强靶点蛋白（图5B），进一步通过SPR（图5C）、pulldown+WB（图5D）、CETSA（图5E）、DARTS（图5F）证明TGM2与毛喉素具有直接结合作用。通过通过构建TGM2截短体证明了毛喉素结合在TGM2催化核心结构域上（图5G），分子对接（图5H）和蛋白点突变技术（图5I）证明毛喉素在TGM2的N229和T368处形成了两个氢键。通过酶活实验发现毛喉素能够激活的TGM2的谷氨酰胺转移酶活性，通过分子动力学模拟发现毛喉素能够诱导的N端结构域产生远离催化核心的构象变化趋势，使TGM2催化口袋暴露在蛋白表面。通过构建荧光共振能量转移（FRET）系统证明毛喉素能够诱导TGM2从“关闭”构象，转变为“开放”构象。同时氢氘交换质谱实验表明毛喉素促进了TGM2催化口袋附近肽段的氢氘交换效率增加，证明了毛喉素通过诱导TGM2变构激活了TGM2的酶活性。

图5毛喉素的直接作用靶点

随后，利用慢病毒构建了TGM2敲低的MC3T3-E1细胞系，发现毛喉素对成骨细胞分化的促进作用依赖于TGM2的存在（图6A）。利用TGM2-APEX2系统（图6B），鉴定发现了TGM2的下游互作蛋白与线粒体能量代谢具有相关性（图6C），提示毛喉素通过提高细胞能量代谢的方式促进成骨分化。最后研究构建了去势骨质疏松模型，证明了毛喉素通过促进成骨细胞分化产生抗骨质疏松的作用（图6D）。

综上，研究发现了毛喉素能够直接与TGM2结合，并通过诱导TGM2的构象变化激活TGM2，通过下游线粒体相关互作蛋白促进细胞能量代谢，从而诱导成骨细胞分化并产生抗骨质疏松作用。

天然产物是药物发现的宝贵资源，目前使用的抗肿瘤药物中约有50％直接或间接来源于天然产物，包括生物碱、多糖、多酚、二萜和不饱和脂肪酸等多种化合物类型。然而，目前对多靶点天然产物的主要作用靶标和作用机制往往不够明确，限制了基于靶标相互作用的结构优化和进一步研发。靶点“钩钓”等新技术的发展对中药功效科学内涵阐释起着极大的助力作用。上面两个案例分别采用TPP的技术手段和ABPP的技术手段阐明了齐墩果酸纳米胶束和毛喉素的直接作用靶点，对我们开展中药小分子靶点研究具有很好的参考价值。

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