|   研究设计

为了寻找PDAC微环境中与转移相关的特异性免疫细胞亚群，研究人员通过CyTOF分析来自11例不同分期PDAC患者（可切除/交界性可切除，BR：4例；局部转移，LA：4例；肝转移，LM：3例）的26份样本（包括11例原发肿瘤组织、10例外周血和5例淋巴结），建立免疫细胞图谱。并通过对这11例样本进行mfIHC，以及公开发表的16例PDAC患者的17个样本的scRNA-seq数据进行了验证，最后分析特定免疫细胞亚群与预后的关系（图1）。

图1 研究设计

1、CyTOF发现与转移相关的T细胞亚群及巨噬细胞亚群

首先，研究人员采用CyTOF对11例PDAC患者的原发肿瘤、淋巴结和血液样本的43个蛋白marker进行检测，结果发现PADC患者血液、淋巴结和原发肿瘤中存在显著的免疫谱系差异。在此基础上，研究人员对患者原发肿瘤微环境中免疫细胞亚群进行分析，发现肝转移组患者原发肿瘤组织中CD103+PD-1+CD4+ T细胞以及CD103+PD-1+CD39+CD4+ T细胞亚群的比例显著低于可切除组（图2A），而且肝转移患者肿瘤组织中存在CD73+CD36+CD49f+巨噬细胞亚群比例显著高于可切除患者（图2B）。结果提示微环境中特定的CD4+ T细胞和巨噬细胞亚群在PDAC转移过程中发挥关键作用。

图2 CyTOF发现与转移相关的T细胞亚群及巨噬细胞亚群

2、mfIHC验证CyTOF结果

随后，研究人员通过肿瘤组织芯片对这11例PDAC进行mfIHC分析，采用T细胞亚型Panel-7指标（CD8、CD4、CD103、PD1、CD39、TIGIT、PVR）和巨噬细胞亚型Panel-4指标（CD36、Integrin 6、CD169、CD68），分别检测PDAC患者中CD103+PD-1+CD39+CD4+ T细胞浸润和CD73+CD36+CD49f+巨噬细胞亚群的分布情况，发现与CyTOF分析结果一致（图3A、B）。研究同样提示微环境中特定的CD4+ T细胞和巨噬细胞亚群在PDAC转移过程中发挥关键作用。

图3 mfIHC验证CyTOF结果

3、scRNA-seq验证CyTOF结果

接着，研究人员利用已公开发表的16例PDAC患者的17个样本的scRNA-seq数据进行挖掘，发现相比于未发生转移的PDAC患者，转移组的原发肿瘤组织中CD103+PD-1+CD39+CD4+ T细胞比例明显降低而CD73+CD36+CD49f+巨噬细胞比例显著升高，进一步验证了CyTOF结果（图4A、B）。研究还通过CellChat互作分析发现，CD103+PD-1+CD4+ T细胞和CD73+巨噬细胞存在多种互作受体配体对，包括TIGIT-PVR、OPN-CD44等，揭示两种细胞之间的多种配体-受体相互作用（图4C）。经mfIHC验证（图4D），CD4+ T cells 表面的TIGIT和CD68+巨噬细胞表面的PVR确实存在潜在的相互作用，提示这两群细胞可能协同调控PDAC转移。

图4 scRNA-seq验证CyTOF结果

4、mfIHC检测两种细胞亚群并揭示其与PDAC预后相关

最后，研究人员结合临床209例PDAC患者肿瘤组织样本，利用mfIHC分析CD103+PD-1+CD4+ T细胞及CD73+巨噬细胞与临床病例特征和预后的关系，同样发现在转移性PDAC肿瘤组织中CD103+PD-1+CD4+T细胞亚群浸润较低（图5A），而CD73+巨噬细胞亚群浸润较高（图5D）。Kaplan-Meier分析显示，CD103+PD-1+CD4+T细胞比例高的PDAC患者整体生存率高于比例低的患者（图5B、C），而高CD73+巨噬细胞浸润的PDAC患者预后较差（图5E、F）。结果表明这两群细胞与PDAC患者转移及生存显著相关。

图5 细胞亚群与PDAC预后的关系

综上，该研究发现了与PDAC转移相关的免疫细胞亚群，CD103+PD-1+CD4+T细胞与CD73+巨噬细胞可能参与调控转移相关免疫微环境的改造，并与PDAC患者生存预后相关（图6）。

图6 特异性细胞亚群及其作用机制模式图

本研究采用质谱流式发现PDAC 患者的原发肿瘤、血液和淋巴结表现出独特的免疫图谱，且PDAC肿瘤微环境中的免疫亚群随临床阶段的不同而变化，寻找到了微环境中与转移相关的免疫细胞变化。进一步通过已发表的单细胞RNA测序数据和多重荧光免疫组织化学得到验证，并揭示了已识别的 T 亚群与巨噬细胞之间通过各种配体-受体对之间的强大潜在相互作用。此外，转移相关免疫亚群的百分比与临床结果密切相关，可以预测PDAC的预后。

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