Cullin-RING连接酶（CRLs）作为最大的E3泛素连接酶家族，参与催化体内约20%的蛋白质泛素化。而蛋白质拟素化（Neddylation）是与泛素化类似的一种类泛素化修饰，其介导的CRLs的激活是特异性免疫调节蛋白降解所必需的。调节性T细胞（Treg细胞）发挥抑制免疫细胞过度活化，维持机体免疫稳态的作用。尽管拟素化修饰/CRLs和Treg细胞都在免疫调节中发挥着重要的作用，但截至目前CRLs和拟素化修饰在调节Treg细胞功能和存活以维持免疫系统稳态方面的机制研究还非常有限。

2022年5月31日, 浙江大学医学院附属第二医院肿瘤研究所/浙江大学转化医学研究院孙毅课题组在Nat Commun（IF=16.6）发表了一篇题为“The Ube2m-Rbx1 neddylation-Cullin-RING-Ligase proteins are essential for the maintenance of Regulatory T cell fitness”的文章，发现Ube2m-Rbx1拟素化-泛素化轴维持调节性T细胞的功能特性。

|   01、Treg细胞中Rbx1缺失损坏抑制功能

为了研究CRLs在体内调节Treg细胞中的作用，研究构建了在Treg细胞中特异性敲除Rbx1（Foxp3cre;Rbx1fl/fl）的小鼠，发现Treg中Rbx1的缺失导致小鼠出现早发致死性炎症紊乱（图1A），多种类型的免疫细胞及细胞因子均被显著激活（图1B）。进一步为了研究Rbx1缺失是否损害Treg细胞的抑制功能，研究者将等量的WT或Rbx1缺陷小鼠Treg细胞与初始CD4+ T细胞一起注射到免疫缺陷Rag1−/−小鼠中进行体内抑制试验。结果显示，注射Rbx1缺陷Treg细胞的小鼠发生了严重的结肠炎（图1C）。这些结果说明Rbx1对Treg细胞的免疫抑制功能是必不可少的。

图1 Treg细胞中Rbx1缺失导致抑制功能受损

为了进一步探究Rbx1缺失对Treg细胞分化的影响。研究者对WT和Rbx1缺失的Treg细胞进行单细胞转录组学数据分析，并分成13个亚群（图2A）。经过分析发现Rbx1缺失导致初始Treg细胞的比例增加，而高表达多种功能分子的效应性Treg细胞比例减少（图2B、C）。这些结果表明Rbx1缺失导致Treg细胞中静稳亚群无法向效应亚群分化。

图2 Rbx1缺陷Treg细胞的单细胞转录组学

Rbx1是E3泛素连接酶的催化亚基，能够催化底物蛋白的泛素化降解。为了确定Treg细胞中Rbx1可能的直接底物，研究者直接比较蛋白质组学和转录组学数据，并推测在Rbx1缺失的Treg细胞中候选底物应该呈现蛋白质丰度升高，而mRNA水平基本不变的情况。由此共找到了57个候选底物（图3A），其中Bim蛋白已被证实可被Rbx1泛素化并降解（图3B），且Bim是一种促凋亡蛋白并参与Treg细胞的调控。因此推测Bim的积累可能部分介导了Rbx1缺陷Treg细胞的某些表型，进一步通过表型挽救实验证实，Bim的敲除部分挽救了Rbx1缺陷鼠严重的炎症表型（图3C），表明Bim部分参与了Rbx1在Treg细胞中的功能。

由于Ube2m与Rbx1 E3偶联促进Cullins1-4的拟素化。为了探究Rbx1在Treg细胞中的关键作用是否依赖于Ube2m。研究者构建了Treg细胞中特异性敲除Ube2m的小鼠。通过细胞因子芯片（welcome-球速体育为该研究提供了检测服务）发现，Ube2m缺失的小鼠也观察到类似但炎症紊乱相对较弱的表型（图4A）。进一步对Rbx1缺陷和Ube2m缺陷的Treg细胞之间的转录组数据进行分析，发现两组确实存在独特的差异基因（图4B）和通路（图4C），表明在Treg细胞中Rbx1的功能只是部分依赖于Ube2m。

图4 Rbx1的调节功能并不完全依赖于Ube2m

作用机制模式图如下：

Wu D, Li H, Liu M, et al. The Ube2m-Rbx1 neddylation-Cullin-RING-Ligase proteins are essential for the maintenance of Regulatory T cell fitness. Nat Commun. 2022;13(1):3021.