T细胞介导的抗原特异性反应对于有效的免疫监视至关重要。然而T细胞如何进入肿瘤微环境并操纵局部组织微环境来实现效应器功能，以及这些局部的细胞结构如何对T细胞疗法或者其他免疫治疗做出反应仍然不清楚。近期来自斯坦福大学的研究者利用小鼠模型和临床患者样本，通过PhenoCycler-Fusion(PCF)空间单细胞蛋白组（原名CODEX）技术识别了对过继T细胞、免疫检查点抑制剂治疗反应相关的肿瘤微环境区域特征[1]。

研究者首先纵向分析了过继T细胞治疗的小鼠模型的肿瘤组织。分别收集了治疗前第0天，治疗后第1、3、5、12天的肿瘤组织，开展了42个抗体检测的PCF空间单细胞蛋白组分析（图1）。鉴定了十几种不同表型和功能状态的免疫细胞和肿瘤细胞。

图1 小鼠肿瘤组织PCF空间单细胞蛋白组检测

研究者着重分析了以CD8+ T细胞为中心的细胞类型间空间关系的变化。随着治疗进程，CD8+ T细胞周围的空间关系发生了明显的动态变化（图2）。治疗后第3天，CD8+ T细胞周围会富集更多的DC细胞，并且增殖的Ki67+肿瘤细胞在CD8+ T细胞周围显著减少；但是在治疗后第5天和12天，CD8+ T细胞空间上远离DC细胞，伴随着的是PD-L1+ 巨噬细胞和PD-L1+MHCI+肿瘤细胞在CD8+ T细胞周围的富集增加。空间单细胞蛋白组分析清晰的展示了细胞治疗如何改变CD8+ T细胞空间关系：CD8+ T细胞浸润到肿瘤区，区域内抗原呈递活动增强，区域内肿瘤细胞从增殖型（Ki67+）到炎症性的转变（PD-L1+MHCI+）。

基于这些空间关系分析，特别是如何营造免疫激活的微环境特征，也是评价和指导不同改造的T细胞疗效的重要方面。乙酰辅酶A受到抑制的T细胞会展现出更好的根除肿瘤的效果，研究者对比分析了乙酰辅酶A抑制剂（2HC）处理的T细胞和正常T细胞治疗后肿瘤微环境的变化。细胞邻域（CN）分析发现了两个治疗组间的存在显著差异的空间关系组成，一个是富集MHCI+肿瘤细胞, CD4+ T细胞, Ki67+ CD4+ T细胞和NK细胞的CN（命名为Productive T cell & Tumor CN）在2HC T细胞治疗组中显著增多，而另外一个是缺少以上的细胞类型而富集Treg和MHCI-肿瘤细胞的CN（命名为Unproductive T cell & Tumor CN）在2HC T细胞治疗中减少。细胞邻域互作界面分析（Spatial context）发现了2HC T细胞治疗可以显著增强Productive T cell & Tumor 细胞邻域和Immune Infiltrate细胞邻域的互作界面，而破环Unproductive T cell & Tumor细胞邻域和Immune Infiltrate细胞邻域的互作（图3）。这些说明了Unproductive T cell & Tumor、Unproductive T cell & Tumor和Immune Infiltrate这3种细胞邻域构成的肿瘤组织区域结构对于治疗疗效非常重要。

图3 细胞邻域互作界面分析

为了解释以上组织区域结构对于不同治疗方法作用的共性，研究者又通过PCF空间单细胞蛋白组分析了6名黑素瘤患者免疫治疗前后的肿瘤微环境变化。包含了3名有响应和3名无响应总共12张组织切片样本，检测了58个抗体（图4）。

图4 黑色素瘤患者肿瘤组织PCF空间单细胞蛋白组检测

细胞邻域分析同样定义了相似的组织结构，特别是也发现了Productive T cell & Tumor和Immune Infiltrate细胞邻域，细胞邻域互作界面分析发现了响应患者在治疗后Productive T cell & Tumor和Immune Infiltrate细胞邻域的互作界面显著增多（图5）。

图5 细胞邻域及互作界面分析

目前某些实体瘤治疗存在的挑战和突出的问题都是和组织空间相关的，包括免疫细胞浸润过程、肿瘤抗原表达以及刺激或抑制免疫细胞的空间共富集，这些可能会带来不同的治疗结果。确定这些空间关系和多细胞邻域将进一步揭示驱动治疗功效的分子和细胞机制。这项研究借助PCF空间单细胞蛋白组技术，揭示了治疗后肿瘤微环境的时间变化、对反应至关重要的细胞相互作用以及免疫治疗结果的空间相关性的组织原位机制，也为细胞治疗评估和工程化改造提供了参考信息。

| PhenoCycler-Fusion单细胞原位空间蛋白组学优势

1.Hickey JW, Haist M, Horowitz N, Caraccio C, Tan Y, Rech AJ, Baertsch MA, Rovira-Clavé X, Zhu B, Vazquez G, Barlow G, Agmon E, Goltsev Y, Sunwoo JB, Covert M, Nolan GP. T cell-mediated curation and restructuring of tumor tissue coordinates an effective immune response. Cell Rep. 2023;42(12):113494.