溃疡性结肠炎 (Ulcerative colitis, UC) 是一种慢性复发性炎症性肠病，是最常见的自身免疫性疾病之一。由于UC患者出现的慢性炎症，他们患结直肠癌的长期风险比健康人要高1.5倍。近年来，UC新的治疗方案不断涌现，其中肿瘤坏死因子抑制剂 (TNFi)是UC的一线靶向治疗药物，可提高持续缓解率并降低手术率。然而13%至40%的UC患者对TNFi治疗无反应，有报告表明在治疗开始后12个月内，高达46%的其他患者出现反应丧失或不良反应。目前识别对TNFi有反应的患者仍然是一个未解决的临床问题，并且缺乏预测性生物标志物来确定在诊断时每个患者的最佳治疗方法。

有研究对患有回肠疾病的克罗恩病患者队列进行过scRNA-seq分析，能够识别出与 TNFi 治疗耐药性相关的免疫细胞模块，虽然具有显著性但是关联性较弱。这些免疫细胞模块的存在表明这些细胞类型之间存在空间上的功能关系，但是这些空间关系信息scRNA-seq无法获得。能够以单细胞分辨率对组织内免疫细胞状态进行空间映射的多重成像技术可以提高我们对细胞相互作用及肠道重塑如何影响UC发病机制和TNFi耐药性的理解。来自斯坦福大学医学院的研究者利用目前最先进的空间组学技术之一PhenoCycler-Fusion（PCF）空间单细胞蛋白组学（原CODEX）技术创建了UC发病过程中肠道组织的空间图谱[1]。研究者对来自29名UC患者和5名健康受试者总共42个肠道组织区域开展了52个蛋白靶标的多重检测，绘制了炎症期间和TNFi治疗患者组织空间上细胞比例、细胞互作和细胞邻域的变化。这些空间表征能够识别可能对TNFi治疗做出反应或保持不变的细胞生态位。并且研究者还观察到患者队列中这些细胞生态位相对丰度存在性别差异性。

图1 一个代表性患者样本的展示

PCF空间单细胞蛋白组学分析了170多万个单细胞，诠释了13种细胞类型。研究发现了某些细胞类型比例的变化呈现疾病程度的依懒性，例如表皮细胞的比例随着严重程度减少，而浆细胞和颗粒细胞逐渐增加。

细胞-细胞互作分析揭示了病人间的异质性。在大部分UC患者中细胞-细胞互作存在于天然免疫细胞之间，小部分患者中是适应性免疫细胞之间互作为主。例如UC14a患者的细胞-细胞互作分析显示了T 细胞主要与B细胞和基质细胞互作，而与先天免疫细胞类型（尤其是中性粒细胞）之间的接触频率较低。UC患者细胞互作之间的异质性导致了组织空间结构的差异以及不同的疾病状态和治疗反应。

图3 细胞-细胞互作分析

细胞邻域（CN）功能状态是根据一种或多种表达某些功能标记的特定细胞类型的局部富集来确定的，其分析提供了一种衡量特定CN的特征在疾病进展和治疗过程中如何影响细胞功能的方法。研究者感兴趣的是TNFi治疗如何影响TNFR2蛋白在各种细胞类型上的分布以及如何影响其功能状态。研究构建了所有患者共有的10个细胞邻域，相比中性粒细胞富集程度最高的细胞邻域CN-0和CN-4，CN-7（炎症血管区域）中TNFR2+ 中性粒细胞频率更高。类似地，PD-1+ T细胞频率差异很大，主要取决于T细胞是否存在于B细胞滤泡附近 (CN-9)、淋巴细胞聚集区域(CN-2)或混合细胞区域中。这些表明了细胞邻域在单个细胞的功能状态中发挥着重要作用。

图4 细胞邻域分析

最后研究者发现了TNFi治疗进程中关键的细胞空间关系的变化，包括天然免疫细胞类型以及以天然免疫细胞为主的细胞邻域的持久存在，还有适应性免疫细胞之间互作关系的改变等。研究也表明了性别对这些空间关系存在显著的影响，与治疗响应相关的细胞空间关系主要存在于女性患者中。

图5 TNFi治疗改变细胞-细胞互作频率和细胞邻域比例

UC和其他自身免疫性疾病是全世界最常见的炎症性疾病之一。TNFi等生物疗法改善了患者的生活质量并减少了这些慢性疾病的长期并发症。然而，由于与生物制剂相关的毒性、不良反应、高失败率和高治疗成本，临床医生需要预测性生物标志物来指导治疗选择。近来使用单细胞技术（例如scRNA-seq 和CyTOF）的研究试图识别此类生物标志物以及患者与健康对照者粘膜内免疫系统的差异,然而，这些技术无法测量组织结构和细胞的空间相互作用。众所周知，组织细胞空间关系可以为疾病进展和治疗反应提供重要的见解。因此，使用PCF空间单细胞组织原位多重成像此类的技术分析UC患者的肠道结构，可以同时在多个水平（细胞类型比例、细胞-细胞互作水平、细胞邻域）上提供以前未识别的生物学见解。

PCF采用oligo偶联抗体检测技术结合自动化高分辨荧光显微镜，可实现超多靶标的空间定位及单细胞分辨率下的细胞表型分析。所有抗体先一次性与组织切片结合，再启动抗体和荧光探针的“杂交 — 成像 — 剥离”三步循环，每次循环后通过荧光显微镜收集检测抗体的荧光信号。

| PCF空间单细胞蛋白组学优势