在胚胎发育过程中，胎儿肝脏是主要的造血器官。其中巨噬细胞是发现的第一个分化的造血细胞，它们对于胎儿红细胞生成非常重要。在胎儿肝脏中，红细胞生成岛 (erythroblastic island, EI) 巨噬细胞充当着红母细胞的生态位。但是巨噬细胞是否在胎儿造血中还发挥其他的作用并不清楚。近期来自德国的研究团队发现了小鼠胚胎肝脏中巨噬细胞存在很大的异质性，并且通过PhenoCycler-Fusion（PCF）空间单细胞蛋白组技术识别了CD169+ 巨噬细胞亚型邻近于造血干细胞（HSC），对于HSC的分化起到非常关键的作用。

研究者首先通过单细胞测序和流式细胞术发现了小鼠胚胎肝脏中除了数量最多的EI巨噬细胞亚型外，还存在3种其他的亚型，这些巨噬细胞亚型存在不同的基因表达谱特征。

为了分析巨噬细胞来源的分子能否介导和HSC之间的互作，研究者分析了巨噬细胞表达的配体和HSC间可能的关联，发现了巨噬细胞表达的很多配体都已经被报道了可以直接或间接作用于造血干细胞促进增殖和扩增，例如Kitl, Igf1, Tnf, Tgfb1和Fn1基因。

为了确定哪种巨噬细胞亚型直接和HSC发生互作，研究者通过PCF空间单细胞蛋白组对小鼠胚胎肝脏组织进行了20个抗体的检测。其中CD45, Iba1, F4/80, Cx3cr1 和 Tim4是泛巨噬细胞的表型marker，在此基础之上巨噬细胞细分亚型分为了：A: CD106+ 巨噬细胞；B: CD206+ 巨噬细胞；C: CD169+ 巨噬细胞; D: Ter119+ EI 巨噬细胞。单细胞原位分析显示了所有巨噬细胞亚型在组织上分散的定位，而CD105+ HSC细胞的定位邻近肝包膜。同样的，胚胎肝脏中Ter119+ EI 巨噬细胞是数量最多的，而其他3种巨噬细胞亚型占比很少。这也体现了PCF空间单细胞蛋白组的技术优势，可以全片成像以单细胞的分辨率捕获稀有细胞亚型的空间信息。

以半径50μm的区域对组织全片进行细胞邻近关系分析，发现了HSC细胞附近富集更多的CD169+ 巨噬细胞。CD206+ 巨噬细胞更多的定位在血管周围。并且共表达分析发现了共表达CD206和CD169的巨噬细胞占比较多。总之，空间关系分析确定了胚胎早期作用于HSC的是CD169+ 巨噬细胞亚型，不同于那些调控红细胞生成的Ter119+ EI 巨噬细胞。

最后研究者验证了体内去除巨噬细胞可以影响HSC的分化趋向性，HSC会分化成更多的中性粒细胞和其他类型的单核细胞。

巨噬细胞是当下的研究热点，也是近几年国自然资助最多的研究方向之一，不管是早期发育过程对器官发生的作用，还是肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫等作用，巨噬细胞已经成为这些研究的焦点。如何分析不同组织微环境中巨噬细胞对靶细胞的作用，关键是要确定和靶细胞直接产生互作的那一群巨噬细胞的类型。这篇文章的研究思路值得大家借鉴，从单细胞测序发现不同亚型，到空间原位上确定不同亚型的位置关系。文中采用的PCF空间单细胞蛋白组可在单细胞分辨率下进行组织原位的超多靶标的检测，相比其他同类技术，PCF能够同步在更大范围的组织区域中分析更多的细分亚型，无遗漏的发现更多关键的空间互作机制。

| PhenoCycler-Fusion单细胞原位空间蛋白组学优势