白塞病葡萄膜炎（Behçet’s uveitis，BU）是我国最常见且致盲率最高的葡萄膜炎类型之一，男性发病率和疾病严重程度皆明显高于女性，确定性别相关差异的潜在机制对于制定疾病精准治疗策略至关重要。近期，重医附一院杨培增团队与山西医科大学郜原团队合作在国际顶级学术期刊《Cell Discovery》（IF=33.5）发表题名为“Sex-specific circulating unconventional neutrophils determine immunological outcome of auto-inflammatory Behçet’s uveitis”的突破性创新研究成果（王青锋，马俊峰，龚宇星为第一和共同第一作者）。

鉴于中性粒细胞在白塞病葡萄膜炎中的重要作用，研究团队通过scRNA-seq揭示了在健康和疾病状态下，男性和女性中性粒细胞组成的差异，特别是鉴定了干扰素-α反应型和T细胞调节型两类非常规中性粒细胞亚群的失调是导致男性患者更易感、病情更严重的重要原因。此外，研究还发现男性特有的遗传因子和循环外泌体对这些中性粒细胞亚群有负面影响（此研究中的外泌体多组学部分由welcome-球速体育提供协助）。该成果首次揭示了具有性别差异的中性粒细胞亚群的重要作用，为自身炎症性葡萄膜炎的防治提供了重要新靶点。

研究者首先收集了来自8名健康男性和8名健康女性外周血中的中性粒细胞进行scRNA-seq分析，结果鉴定了5种中性粒细胞亚群，包括3种常规功能性的中性粒细胞亚群（炎症型、趋化型和活性氧反应型）和2种非常规的中性粒细胞亚群（干扰素-α反应型和T细胞调节型）。男性和女性之间的差异表达基因功能分析及细胞通讯分析揭示了中性粒细胞介导的炎症反应在男性中更为突出，然而中性粒细胞相关的T细胞调节功能在女性中更为活跃（图1）。

图1 健康人中性粒细胞的性别差异性

研究者进一步收集了8名女性白塞病葡萄膜炎（BU）患者和10名男性BU患者外周血中性粒细胞进行scRNA-seq，结果发现了中性粒细胞亚群在男性患者和女性患者之间具有显著差异性。男性患者中常规的炎症型中性粒细胞亚群增多，而2种非常规中性粒细胞（干扰素-α反应型和T细胞调节型）减少，尤其是T细胞调节型几乎完全丢失。差异表达基因分析进一步证实了男性患者中上调基因与中性粒细胞脱粒、白细胞激活、趋化和细胞外诱捕网（NET）形成相关，而男性患者下调基因主要与干扰素-α反应和T细胞活性有关（图2）。女性患者中干扰素-α反应和T细胞调节会启动细胞间的保护程序有利于炎症消退，而男性患者中缺少这些中性粒细胞亚群，并且富集促炎的中性粒细胞亚群和信号，进一步加重男性患者疾病的严重性。

图2 BU患者中性别差异的中性粒细胞亚群

研究者回顾性分析了310名女性BU患者和1571名男性BU患者的临床数据，相比健康人群和另外一种自身炎症疾病VKH患者，在男性和女性BU患者中中性粒细胞都显著增多。但是只有在男性患者中，相比非活动期，中性粒细胞在活动期会显著增多。说明了中性粒细胞与男性疾病的严重程度有关。进一步研究者发现了这些男性患者视力低下和失明的风险显著高于女性患者（图3）。

图3 中性粒细胞与男性患者严重程度相关

首先拟时序分析揭示了干扰素-α反应型向T细胞调节型分化的轨迹。通过干扰素IFN-α2a处理，中性粒细胞会获取T细胞调节表型（高表达ANXA1），而细胞共培养实验发现IFN-α2a处理的中性粒细胞还会增加CD4+ T细胞中Treg细胞的比例（图4a），验证了拟时序分析的结论。进一步，研究人员构建了中性粒细胞特异敲除ANXA1基因的小鼠，结果发现了相比正常小鼠，Treg细胞在敲除小鼠中显著减少。同时，过继细胞转移实验发现了只有在雌性小鼠中转移ANXA1+中性粒细胞后会增加Treg细胞，而不是在雄性小鼠中（图4b）。并且体内处理IFN-α2a也会增加雌性小鼠中的ANXA1+中性粒细胞和Treg细胞（图4c），这些结果说明了中性粒细胞亚群免疫调节的性别差异性。

图4 功能验证两类非常规中性粒细胞的免疫调节作用

最后研究者分析了男性患者中非常规中性粒细胞亚群的减少的潜在原因。首先考虑的因素就是性别之间的遗传差异性，研究人员利用GWAS分析发现的男性患者中存在的与非常规中性粒细胞亚群的缺失相关的风险SNP位点。而另外一个因素，研究人员从外周血的免疫微环境着手，在welcome-球速体育的协助下进行了外泌体多组学分析（图5a）。首先，外泌体蛋白组学揭示了男性患者和健康者间显著差异的蛋白主要与免疫反应、中性粒激活有关（图5b,c）。而外泌体miRNA测序发现了大部分显著差异的miRNA存在于男性人群中，其中25个miRNA是男性患者特异的差异miRNA（图5d），这些miRNA的靶基因有很多是干扰素信号通路基因和T细胞调节的基因（图5d），说明了男性患者中循环外泌体miRNA会抑制中性粒细胞的干扰素信号和T细胞调节功能。进一步，将外泌体和中性粒细胞共孵育，发现来自男性患者血浆的外泌体会更加显著地抑制中性粒细胞的干扰素反应和T细胞调节表型的marker表达（图5e,f）。这些结果说明了男性患者循环外泌体会抑制非常规中性粒细胞亚群，为单细胞测序发现的BU活动期男性非常规型中性粒细胞丢失找到了原因。

图5 外泌体介导男性患者中非常规中性粒细胞亚群的缺失

鉴于中性粒细胞过度活化是白塞病葡萄膜炎发生的重要生理过程之一。该研究团队以中性粒细胞为主要研究对象，证实了外周血中性粒细胞中存在两种具有性别差异的非常规细胞亚群，这两种非常规细胞亚群在T细胞免疫平衡中起着重要的调控作用，且与性别、疾病严重程度和预后有重要的相关性。该研究成果在中性粒细胞层面解释了白塞病葡萄膜炎在男性中发病率更高且预后更差的原因，也为白塞病葡萄膜炎防治和精准治疗策略的制定寻找到重要突破口。

Wang Q, Ma J, Gong Y, Zhu L, Tang H, Ye X, Su G, Huang F, Tan S, Zuo X, Gao Y, Yang P. Sex-specific circulating unconventional neutrophils determine immunological outcome of auto-inflammatory Behçet's uveitis. Cell Discov. 2024;10(1):47.