阿霉素（DOX）是一种有效的抗癌药物，但其临床应用受到剂量依赖性心脏毒性的限制，严重影响患者预后，究其原因可能与心肌细胞铁死亡有关。然而，开发抗铁死亡的心脏保护药物的进展遇到了障碍，目前尚无针对其发病机制的有效治疗手段。

为了揭示PrA对DIC保护作用的分子机制，研究人员进行了心脏组织RNA测序，结果发现DOX组中的显著差异表达基因（DEGs）富集在铁死亡通路上，而PrA的添加显著降低了DEGs在铁死亡通路上的富集，GSEA分析发现了同样的结果（图2A）。随后检测了铁死亡标记物Ptsg2的基因表达水平（图2B）和铁死亡相关的必需调节蛋白GPX4、ACSL4和FTH1的蛋白表达水平（图2C），结果验证了RNA测序数据的准确性。最后，通过FerroOrange染色将细胞质中的Fe²⁺进行荧光标记（图2D），结果显示：相较于DOX组，PrA的处理有效降低了细胞内Fe²⁺的含量。

图2 PrA能减轻DOX诱导的心脏组织铁死亡

HuProt 20K人类蛋白组芯片是一种高通量蛋白质分析工具，包含23145个纯化的人类蛋白质，覆盖了人类基因组中大部分蛋白质，可用于蛋白组功能研究、疾病标志物发现和药物靶点筛选。为了确定PrA抑制DOX介导的心肌细胞铁死亡的潜在机制，研究人员采用HuProt 20K人类蛋白组芯片进行PrA作用靶点的筛选。将生物素标记的PrA与HuProt 20K人类蛋白组芯片杂交（图3A-C），将结合到的蛋白进行KEGG富集分析，结果显示PrA结合蛋白集中富集在铁死亡相关途径（图3D）。其中结合强度最高的两个蛋白是 ACSL4和FTH1（图3E-F），Pulldown+WB实验证实了PrA与ACSL4 和 FTH1的结合（图3G）。

图3 PrA结合蛋白在HuProt 20K人类蛋白组芯片上的鉴定

为了研究PrA如何与ACSL4和FTH1相互作用，研究人员开展了分子对接和动力学模拟实验。分子对接结果表明，PrA与ACSL4通过偶联形成广泛的疏水相互作用，而与FTH1是通过常规氢键和π-alkyl形成亲水性-亲脂性协同作用（图4A）。动力学模拟结果展示了PrA与ACSL4和FTH1结合的关键残基对各残基能量贡献的直方图（图4B）。而为了验证分子对接和动力学模拟实验的结果，研究人员进行了细胞热移测定（CETSA, 图4C）。结果表明，PrA与ACSL4、FTH1之间发生了物理相互作用，PrA直接结合这两个靶点。

图4 PrA与ACSL4和FTH1相互作用的研究

研究人员通过转染siRNA或特异性靶向 ACSL4 的过表达质粒，在H9c2细胞中评估ptgs2的表达水平（图5A）。流式细胞术显示，ACSL4过表达削弱了PrA对DOX诱导的心肌细胞死亡的保护作用（图5B, E）。FTH1可通过与受体NCOA4结合并将含铁的铁蛋白复合物转移到自噬溶酶体进行自噬降解来介导铁蛋白吞噬，从而导致游离Fe²⁺的释放并增加细胞对铁死亡的敏感性。免疫共沉淀实验证实了PrA可以削弱DOX对FTH1与其受体之间的相互作用（图5C）。为了阐明PrA预防DOX诱导的铁自噬的机制，研究人员使用特异性荧光探针追踪Fe²⁺和溶酶体，通过激光共聚焦显微镜发现，PrA抑制了DOX诱导的细胞内Fe²⁺从溶酶体释放到细胞质中（图F, D）。

综上，PrA可以通过阻止DOX诱导的ACSL4 Thr328磷酸化及活化，还可以破坏NCOA4-FTH1的相互作用，抑制铁蛋白自噬和溶酶体Fe²⁺的释放，最终改善DOX诱导的心肌细胞铁死亡。

近年来的研究表明，铁死亡与心肌缺血再灌注（I/R）密切相关。研究人员建立了心肌I/R小鼠模型，发现PrA治疗可部分恢复I/R诱导的血清心肌损伤（图6A-B）。为了阐明PrA在心肌I/R损伤中对铁死亡的保护机制，通过q-PCR检测发现在PrA处理的I/R小鼠中，ptgs2 mRNA水平显著下调（图6C）。组织学染色显示PrA显著改善了I/ R诱导的心脏纤维化（图6E）。PrA治疗恢复了小鼠心脏组织中GPX4、ACSL4和FTH1蛋白、铁和ROS含量（图6D, F和G）的变化。综上，PrA对心肌I/R损伤具有抗铁死亡和心肌保护作用。

图6 PrA减轻缺血再灌注诱导的心脏损伤和功能障碍

本研究通过HuProt 20K人类蛋白组芯片确认了PrA可以靶向调控ACSL4/FTH1轴来抑制铁死亡，最终减轻DOX诱导的心肌损伤和心脏功能障碍。此外，在心肌 I/R 小鼠模型中阐明了 PrA 的心脏保护和抗铁死亡作用。研究结果表明PrA可以作为一种新型的双重铁死亡靶向抑制剂，在DIC和其他铁死亡介导的疾病的潜在治疗途径中具有良好的进展和转化价值，可以为化疗药物引起的心脏毒性和铁死亡引发的疾病提供了额外的治疗选择。

HuProt 20K人类蛋白组芯片含有大约2万多个人类基因编码的蛋白，芯片上的蛋白采用酵母表达系统，逐个进行表达与纯化鉴定。在芯片上每个蛋白质均设置技术重复，并设有多种质控点，确保实验体系稳定可靠。该技术的优点在于：

l 更全面：体内很多结合现象稍纵即逝，很难捕捉，芯片筛选可以发现更全的潜在结合;

l 更灵敏：芯片上的蛋白是酵母纯化表达的蛋白，可以保证每种蛋白的丰度，对于体内低丰度蛋白的结合也容易发现；

l 更高效：相比酵母双杂交实验，芯片实验周期短、假阳性率低，实验设计方便，可以设计多种实验对照，更能确保互作蛋白数据的准确性。

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