巨噬细胞作为组织内的免疫哨兵细胞，在免疫防御中具有多重功能，包括病原体的识别与防御、抗原的呈递、吞噬垂死细胞以及分泌信号促进组织修复。在肿瘤中，巨噬细胞的浸润常与不良的疾病预后相关联，因此被视为潜在的癌症治疗靶点。然而，目前针对肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的单一疗法在实体瘤治疗中效果有限，主要是因为这些方法未能充分考虑到巨噬细胞的多样性。因此，深入解析巨噬细胞的分子特征和功能异质性，将有助于开发更为有效的靶向治疗策略，并提高临床治疗效果的预测能力。

研究团队利用四个公开的结直肠癌和乳腺癌scRNA-seq数据集发现了不同巨噬细胞亚型的标记物（图 1A），通过基因差异富集情况，共区分了11个转录亚群，3个单核细胞亚群、5个TAM亚群（肿瘤相关巨噬细胞）、3个TRM亚群（组织驻留巨噬细胞 ）（图 1C 、D），其中FOLR2⁺TRM亚群尚未报道过。作者验证六种巨噬细胞亚群的marker对应的商品化抗体，以IL4I1、NLRP3、SPP1、FOLR2、LYVE1和MARCO蛋白表达为基础来分辨TAM和TRM群体（图 1G）。

图1 通过scRNA-seq鉴定巨噬细胞亚群

为了研究乳腺癌和结肠癌TME中巨噬细胞标记物的空间分布，作者使用CD68和CD163作为典型巨噬细胞标记物，使用IL4I1、NLRP3和SPP1来区分TAM 亚群，使用FOLR2来区分TRM。结果发现，以往普遍的观点认为的与肿瘤生长和转移相关的CD163⁺细胞本研究反而定位于距离肿瘤更远的部位（图 2B），而 CD68表达较高的巨噬细胞则浸润并紧紧包围肿瘤巢（图 2B 、D ）。FOLR2 的表达与良性组织有关，其位置离肿瘤较远（图 2E-G），在空间上与CD163表达较高的巨噬细胞共定位（图 2D ）。而表达IL4I1、NLRP3和SPP1的巨噬细胞则富集在肿瘤附近，在空间上与CD68表达较高的巨噬细胞共定位（（图 2D ii）。

IL4I1⁺巨噬细胞存在于肿瘤巢周围的促纤维增生基质中，FOLR2⁺巨噬细胞存在于更远的周围良性组织中。这表明肿瘤的存在以类似的方式塑造TME中的巨噬细胞表型和分布，而与肿瘤类型或肿瘤是原发性还是转移性无关。该团队将分析研究扩展到了八个不同器官起源癌症，发现所有分析的肿瘤中均存在FOLR2⁺ TRMs和IL4I1⁺ TAM的空间异质性。

图2 FOLR2、IL4I1、NLRP3和SPP1在TME中标记巨噬细胞异质性

IL4I1定位于抗原呈递细胞的溶酶体中，提示其在吞噬作用中起作用。使用基因集富集分析进一步研究吞噬作用与IL4I1阳性TAMs之间的关联。发现与其他所有scRNA巨噬细胞亚型相比，CXCL9阳性TAMs（IL4I1阳性TAMs的一个亚群）在吞噬体、溶酶体、内吞作用和抗原处理与呈递基因集表达中最为富集（图3A）。SIRPA（编码CD47配体）和CD274（编码PD-L1）都在表达IL4I1的scRNA髓系簇中富集，包括SPP1阳性TAMs、ISG15阳性TAMs和CXCL9阳性TAMs（图4B）。提示IL4I1阳性TAMs可能是抗CD47和抗PD-L1免疫疗法的潜靶点，这些疗法可能影响IL4I1阳性TAMs的吞噬潜力。无论是治疗前还是治疗后，响应治疗的患者中表达IL4I1的scRNA TAMs的频率都增加了（图4C、D），表明IL4I1是PD-1-PD-L1轴阻断反应的潜在新预测标记。

图3 IL4I1 标记吞噬巨噬细胞

在确定了IL4I1、NLRP3、SPP1、FOLR2和LYVE1巨噬细胞群体在空间上存在异质性之后，作者利用PhenoCycler-Fusion（PCF）空间单细胞蛋白组（原CODEX）在乳腺和结肠良性及肿瘤组织切片上同时可视化36个蛋白标记以揭示这些细胞的空间关系。PCF抗体组包含四种常规的髓系标记物（CD16、CD68、CD163、CD206）和三种巨噬细胞亚群特异性标记物（SPP1、LYVE1 和 FOLR2）。利用 PCF确定了两种上皮细胞类型、七种基质细胞类型和 15 种免疫细胞类型，在免疫细胞类型中，分辨出了五种巨噬细胞群。PCF成像结果证实前期 scRNAseq 和 IF 结果，并且能够识别良性和肿瘤组织中巨噬细胞亚型与其他细胞类型之间的空间关联。具体的，SPP1⁺TAMs与CD68⁺TAMs共同富集在肿瘤细胞附近，定位于缺氧的肿瘤区域，并与中性粒细胞浸润有关。相比之下，CD163⁺TRMs、FOLR2⁺TRMs和LYVE1⁺TRMs则共同富集在距离肿瘤较远的邻近良性组织中（图4B-D）。FOLR2⁺TAM构成肠肌壁中的组织驻留巨噬细胞群，并与肠道固有层和结缔乳腺组织中的浆细胞相关。来自乳腺结缔组织或肠肌壁的FOLR2⁺TRMs可以被捕获在生长的肿瘤巢内，从而成为TME的一部分（图 4F）。

图4 PCF揭示了巨噬细胞微环境中的空间细胞相互作用

PCF空间细胞邻域分析揭示了SPP1⁺TAM与中性粒细胞在空间共富集。作者还发现NLRP3⁺TAM在中性粒细胞浸润的肿瘤区域富集（图 5A）。然而SPP1⁺TAM与含有坏死组织的区域相关（图 5B）。作者使用了公开的10× Visium FFPE人乳腺癌样本进一步探讨SPP1+TAM与坏死的关联，结果表明该样本中的坏死肿瘤区域富含SPP1⁺基因表达而非NLRP3⁺基因表达（图 5C）。这些结果表明，NLRP3⁺TAMs很可能有助于嗜中性粒细胞在TME中的招募，而SPP1⁺TAMs可能在吞噬坏死肿瘤区域中发挥作用。

研究团队使用CosMx SMI等技术发现NLRP3⁺TAMs通过激活NLRP3炎性体参与炎症的发生，并驱动中性粒细胞浸润。相反，SPP1⁺TAMs通过清除缺氧肿瘤区域的坏死病灶，在组织修复中发挥作用（图5D）。

图5 NLRP3⁺TAMs和SPP1⁺TAMs的功能异质性

作者将IL4I1⁺TAMs和SPP1⁺TAMs的丰度与结直肠癌患者的临床结局相关联，来阐明它们对肿瘤生物学的生物学影响。发现IL4I1⁺TAMs在两个独立的结直肠癌队列中是良好预后的强预测因子（图 6A 、B），SPP1⁺ TAMs则与结直肠癌的不良预后相关（图 6C）。这与SPP1⁺TAMs与肿瘤坏死和缺氧的空间关联一致，而肿瘤坏死和缺氧都是肿瘤侵袭性的标志。

作者表示这是首个基于蛋白质的证据，显示了在实体肿瘤中，两种TAM群体之间存在相反的临床结局相关性。这表明不同的TAM群体之间存在分工，以不同的方式影响患者的预后。

图6 IL4I1⁺TAM和SPP⁺TAM与CRC患者预后有关

本研究利用单细胞公共数据库挖掘发现了5种巨噬细胞亚群，进而通过包含PhenoCycler-Fusion空间单细胞蛋白组（原CODEX）在内的多个空间组学技术深入解析了巨噬细胞群体的空间分布及其与疾病进程的关联。研究揭示了巨噬细胞并非随机分布于组织，而是根据其独特功能，占据特定的生态位。巨噬细胞的空间组织特性与其功能状态紧密相关，针对巨噬细胞的空间特异性干预策略，可能成为未来肿瘤免疫治疗的新方向，有望提高治疗的精准性和有效性。

| 空间多组学整合方案

| PCF空间单细胞蛋白组学优势