肝细胞癌(HCC)手术后的复发率高达60%-70%，其手术后的微小残留灶（MRD）是癌症复发转移的元凶。在经动脉化疗栓塞(TACE)反应良好的非转移性HCC患者中，大部分肿瘤细胞被清除，但仍然会留下一小部分残留肿瘤细胞。即使经过长时间的潜伏期，这些残留的肿瘤细胞也可能导致复发，复发的肿瘤病灶通常对治疗无反应，直接导致复发患者生存率低。因此，研究残留肿瘤细胞逃避治疗后免疫监视的过程，对于预防复发和改善预后至关重要。

近日，斯坦福大学医学院的研究团队在Nature Cancer (IF=22.6)上发表了题为“Spatial analysis reveals targetable macrophage-mediated mechanisms of immune evasion in hepatocellular carcinoma minimal residual disease”的研究。本研究利用PhenoCycler-Fusion(PCF)空间单细胞蛋白组技术绘制了人残留肝癌组织空间原位上不同的细胞类型及分布，并以细胞邻域的视角进行空间互作关系的解读；结合单细胞测序与小鼠模型数据，共同揭示了残留肝癌细胞导致肝癌复发的机制，并提出了可能的治疗方法。

为了阐明化疗栓塞后残留的HCC中肿瘤和免疫细胞的空间情况，作者构建了一个完整的人类HCC单细胞空间图谱。作者借助PCF空间单细胞蛋白组技术，使用了41种抗体，对108个HCC样本（55个残余HCC、53个原发HCC）进行成像，鉴定了HCC中11种主要细胞类型（图1B，PanCK+肿瘤细胞、CD68+巨噬细胞、CD20+B细胞、CD3+CD8+T细胞等）及其空间分布情况（图1A）。接下来，作者依据空间数据，对HCC区域的细胞进行分群（主要分为肿瘤细胞、巨噬细胞和T细胞），并对各个群体进行亚群分析（图1B、C）。

接下来，作者分析了残留和原发的HCC中肿瘤和免疫细胞亚群差异。作者发现残留HCC中免疫抑制性肿瘤细胞和免疫细胞亚群的浸润显著高于原发性HCC，且中性粒细胞和成纤维细胞也相对更少（图2A-C）。除了上述细胞比例的区别，作者还观察到残留HCC和原发性HCC在细胞功能状态上的差异，即残留HCC的肿瘤细胞表现出更多地干细胞样（CD44high、CK19high）表型、具有更多的PD-L1+巨噬细胞；浸润的CD8+T细胞与NK细胞更加处于耗竭状态（图2D-F）。总之残留的HCC具有癌细胞干性、肿瘤巨噬细胞富集和免疫监视降低的特征。

除了细胞表型和功能状态，残留和原发HCC之间的差异可能与细胞相互作用相关。作者重点研究了肿瘤细胞、巨噬细胞和CD8+T细胞的互作关系（图3A）。作者发现与原发HCC相比，残留HCC中四种类型的肿瘤细胞与PD-L1+巨噬细胞的直接互作更加频繁，而肿瘤细胞与CD8+T细胞的互作则没有差异（图3B）。为了探究更高阶的空间组织关系，作者定义了细胞邻域（CN）的概念，以单个细胞及其周围细胞的分布模式来解释空间图谱，在图谱中定义了9个不同的细胞邻域（图3C、D）。作者发现，残留HCC中两个邻域的出现率更高，分别是M2样巨噬细胞免疫邻域和血管炎性肿瘤邻域；而先天免疫邻域和T细胞免疫邻域在残留HCC中出现频率较低（图3E），这可能直接导致残余HCC细胞具有逃避免疫监视的能力。

图 3 特殊的细胞空间邻域可能是导致残留HCC免疫逃逸的原因

接下来，作者发现在转移性HCC（MT-HCC）的小鼠模型致癌基因失活后，MT-HCC小鼠肝脏中存在很多残留肿瘤细胞，可以用于模拟人类HCC中的微小残留病灶（图4A）。作者对含MRD的肿瘤区域进行显微切割进行scRNA-seq，并从相应的基因集富集分析数据中发现，这些细胞在转录水平上与胚胎干细胞系非常类似，祖细胞或癌症干细胞相关的基因特征在MRD的细胞中高度富集（图4B、C），表现出癌症干性。作者发现MRD的单细胞分析数据中，PD-L1-high巨噬细胞有明显富集，且共表达TGFβ1（图4D）。作者认为，残留肿瘤细胞招募分泌TGFβ1的PD-L1+巨噬细胞进入MRD。而后作者进行流式细胞术，发现MRD内耗竭的CD8+T细胞显著增加（图4E），与人类HCC中观察到的结果相符。这表明在残留HCC中，免疫监视发生了受损的情况。作者接下来使用Tgfbr抑制剂和PD-L1抗体处理残留HCC，发现联合治疗促进了CD8+T细胞的募集和激活，减少了PD-L1+巨噬细胞，使得肿瘤指标发生显著下降，阻止了肿瘤复发（图4F、G）。

图 4 小鼠模型揭示微小残余病灶导致癌症复发的原因和治疗方式

本文借助PCF空间单细胞蛋白组技术绘制了肝癌组织的空间蛋白图谱，揭示了人类残留肝癌组织导致肝癌复发的机制，并提出了一种可能的治疗方法。作者发现，残留肿瘤组织中干细胞样肿瘤细胞和免疫抑制PD-L1+巨噬细胞间的相互作用与CD8+T细胞耗竭相关，残留肿瘤细胞内TGFβ通路的激活使得人类和小鼠中微小残留病灶持续存在，导致了肝癌的反复发生，TGFβ和PD-L1是消除肝癌中微小残留病灶的关键着手点，为消除肝癌高复发率的研究提供了宝贵的理论依据。

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