2023年Nature发表了一项利用PhenoCycler-Fusion（PCF）空间单细胞蛋白组（原CODEX）技术诠释肠道组织结构图谱的文章，题名为“Organization of the human intestine at single-cell resolution”。该研究定义了肠道内不同细胞类型的相对丰度和空间位置关系，包括不同肠道区域上皮细胞的复杂性，以及细胞组织成不同的多细胞结构生态位。并且联合单细胞测序绘制了这些细胞中的基因调控差异图谱，揭示了这些细胞类型间的调控分化级联关系。这项研究对肠道这个复杂器官的细胞功能、调节和组织结构提供了重要的见解，并为理解人肠道疾病提供了重要参考。

研究分析了来自8个健康捐献者的组织样本。PCF空间单细胞蛋白组检测了54个蛋白指标，总共注释了25种细胞类型，覆盖了不同的基质细胞、表皮细胞和免疫细胞类型。不同细胞亚型在不同肠道区域的占比和密度不尽相同，说明了肠道不同区域的功能异质性。组织空间分析鉴定了18个细胞邻域（Neighborhood），然后根据这些细胞邻域间的细胞类型比例聚类得到了10个细胞社区（Community），最后和肠道组织的4个结构单元（粘膜、外肌层、粘膜肌层、粘膜下层）进行整合，构建了肠道的组织层级结构。

近期《Nature》上发表了一项类似的延伸工作，对小肠上皮特定的结构单元隐窝-绒毛单位进行了更加细致的研究，题名为“A spatial expression atlas of the adult human proximal small intestine”。小肠上皮是由重复的隐窝-绒毛单位组成的高度结构化的组织，位于不同隐窝-绒毛区域的细胞在高度可变的微环境中运行。小鼠小肠沿隐窝-绒毛轴表现出显著的的基因表达异质性，而成人肠道是否存在类似的空间异质性尚不明确。研究成人肠道的基因空间表达异质性有助于加深对成人小肠相关的生理特性的理解。该文章结合了Visium 空间转录组学、PCF空间单细胞蛋白组和单分子荧光原位杂交技术重建了成人近端小肠的空间结构图谱，为在理解人体肠道细胞的分子特性和功能特化提供了参考。

为了绘制人类小肠粘膜和粘膜下层的详细基因表达图谱，研究团队收集了8名胰十二指肠切除手术中获得的近端小肠样本，这些样本大多来自胰腺癌患者，但小肠本身大多无病变。通过Visium空间转录组和H&E图像上，准确区分出不同的组织区室——腔、黏膜下层、固有层、黏膜肌层、顶端上皮和基底上皮。进一步利用PCF空间单细胞蛋白组，使用37种抗体对三位患者的样本进行了分析，将 226,529 个细胞分成 18 种主要细胞类型，并以真正的单细胞分辨率确定它们沿隐窝-绒毛轴和基质-上皮轴的空间关系和位置（图1）。

图1 成人近端小肠空间表达图谱

研究发现基因表达沿着隐窝-绒毛轴线展现出显著的空间分区模式。在分析隐窝-绒毛分区时，研究者鉴定了8915个高度表达和分区化的基因（图2a),并对这些基因进行了上皮亚型的分类发现了上皮细胞特异性基因在隐窝到绒毛顶端的顺序表达模式，例如，REG1A和DMBT1在隐窝中高表达，而APOA4和AQP10在绒毛顶端表达量最高（图2b-e)。此外还观察到内分泌细胞、杯状细胞、簇状细胞以及Best4细胞中基因表达的分区模式。研究还通过smFISH、PCF空间单细胞蛋白组等验证了这些分区模式的准确性（图2f-h）。此外研究揭示了人类与小鼠在这些分区模式上的显著差异，特别是在抗菌防御和抗原呈递相关基因的表达方面。

图2 沿着隐窝-绒毛的上皮基因分区表达模式

作者揭示了脂肪酸吸收和铁代谢途径在小肠绒毛轴线上存在显著的空间分工现象。脂质代谢要经过脂滴形成、甘油三酯（TG）合成和乳糜微粒组装的过程，作者对相关的基因进行分析，发现脂肪滴的形成和甘油三酯的再合成在绒毛的不同区域发生，其中发现脂滴形成相关基因在隐窝区高表达，而TG合成相关基因在绒毛中部高表达，与乳糜微粒组装相关的基因则在绒毛底部高表达（图3a、b）。这种空间上的分离有助于减缓脂质的吸收，防止餐后血脂急剧升高。类似地，铁的摄取、储存和分泌过程也沿绒毛轴在空间上分离，铁的摄入相关基因在隐窝和绒毛底部进行，而铁的分泌相关基因集中在绒毛顶端（图3e-g）。还通过激光捕获显微切割测序技术(LCM-seq)验证了上皮细胞蛋白质和mRNA的分区表达模式高度一致。这些发现为理解人类小肠在吸收脂肪和调节铁平衡中的功能提供了重要见解。

图3 小肠细胞脂质吸收和铁代谢途径中mRNA的分区表达

作者用免疫监视活跃部位的小肠固有层（LP），使用PCF空间单细胞蛋白组技术，将样本分为18种上皮细胞、间充质细胞和免疫细胞类型，分析了它们在隐窝-绒毛轴和基质-上皮轴的分布模式（图4a、b）。根据结果，可以看出CD4+ T细胞和常规树突细胞显著分布于绒毛底端（图4b），而CD8+T细胞、巨噬细胞则偏向分布于绒毛顶端（图4c）。CD4+与CD8+T细胞在基质-上皮轴的分布也具有显著的差异（图4c）。值得注意的是，CODEX分析发现了两种不同的PDGFRA⁺特洛细胞类型/状态，其中一组特洛细胞显著高表达腱生蛋白ECM组分TNC和TNR（图4a）。与CODEX分析一致，Visium数据中绒毛底部和顶部的差异基因表达显示，绒毛底部的浆细胞以及绒毛顶部的巨噬细胞和T细胞显著升高（图4d、e）。绒毛尖端富含γδ T/NK细胞的基因marker，如δ链T细胞受体基因TRDC（图4f），而αβ T细胞受体恒定链基因TRAC、TRBC1、TRBC2则沿着隐窝-绒毛轴均匀表达。内皮细胞富含的配体CXCL10、CXCL14和IL15与其各自的γδ-T/NK细胞富含的受体CXCR3、IL2RB和IL2RG在空间上共表达，小肠细胞富含的配体IL18和IL32与其γδ-T/NK细胞富含的受体IL18R1、IL18RAP和ITGB7在空间上共表达（图4g）。这些结果表明，人类小肠绒毛顶端是一个免疫活性微环境，这可能与人类肠道免疫防御机制有关。

图4 固有层的细胞类型分区分布和分区基因的表达

人类小肠的绒毛结构相较于小鼠具有更高的形态复杂性，尤其在圆形褶皱的顶部区域，存在大量特殊的锯齿状绒毛（图5a-d）。针对绒毛三维形态进行观察，发现在二维切片中观察到的锯齿和分支结构具有两个重要的特征：绒毛上的凹槽是叶子形的，并且它们存在着较大的形态学分叉（图5e-g）。对比了锯齿状绒毛和直指头形绒毛的基因差异，发现它们之间仅有两个基因具有差异（MALAT1和IGHA2，均在直指头形绒毛中更高表达）。这说明，不同形态绒毛间的基因表达差异极小，锯齿状绒毛的作用可能更多表现在如增加肠道面积、产生微绒毛的机制等方面。

图 5 人类锯齿状绒毛的形态学特点

通过结合PhenoCycler-Fusion空间单细胞蛋白组与空间转录组学、单分子荧光原位杂交，构建了一个全面的，高灵敏度和高空间分辨率的成人近端小肠的空间表达图谱。揭示了小肠绒毛上存在显著的空间异质性和隐窝-绒毛轴的代谢特化模式。研究还揭示了人类小肠绒毛中免疫特性与小鼠小肠绒毛的不同之处，并对人类小肠绒毛进行形态学的特殊性进行观察，为成人小肠相关的生物学研究提供了详细的分区蓝图，为理解小肠的生物学功能和疾病研究提供了新的视角和资源。

|空间多组学整合方案

| PCF空间单细胞蛋白组学优势