天然产物是新药开发的主要来源，与细胞内蛋白质靶点的相互作用是其发挥药理活性的基础。随着生物学的发展和后基因组时代的到来，越来越多的科研人员整合了合成化学、细胞生物学和质谱等多种方法，利用化学蛋白质组学方法筛选天然产物中的靶蛋白。中国中医科学院中药研究所王继刚教授团队在《Signal Transduction and Targeted Therapy》上发表题为“Target identification of natural medicine with chemical proteomics approach: probe synthesis, target fishing and protein identification”的综述文章，对天然产物靶标鉴定的两个关键步骤：探针合成及靶点筛选的方法进行了总结概述，再次证明了靶点的研究对于推动发现治疗性天然化合物的重要性。

化学蛋白质组学是经典药物亲和色谱法的后基因组版本，整合了合成化学、细胞生物学和质谱等多种方法。靶点筛选的化学蛋白质组学方法可分为两类，即活细胞水平上的蛋白质组学（ABPP）和以化合物为中心的化学蛋白质组学（CCCP）。两者都是先合成探针，接着将探针与含有靶标蛋白的裂解液混合，之后对其进行富集，对富集成分进行蛋白质鉴定，最后确定化合物的下游靶点蛋白。

图1 靶点筛选的化学蛋白质组学方法分类

设计和合成探针是靶点筛选方法中识别下游靶点蛋白的初始和关键步骤。标记探针由反应基团（药物分子）、报告标签（例如生物素、炔烃或荧光基团）和连接子（用于连接反应基团和报告标签，例如PEG链）三部分组成，它们负责各自的功能，根据报告标签的不同，可以将报告标签分为固定化探针、活性探针、点击化学探针和光亲和探针四类。

图2 化合物标记的探针类型

（1）固定化探针。即天然产物被共价固定在生物相容的惰性树脂上，如琼脂糖和磁珠，作为钩钓的诱饵，以获取活性蛋白质组中的目标蛋白，对所得复合物洗脱后，通过SDS-PAGE和银染法检测靶标蛋白并验证。固定化探针比较经典，应用广泛，但固定化时的位阻和活性损伤是其主要的局限性。

图3 固定化探针靶点筛选原理示意图

（2）活性探针。即在天然产物上引入一个报告基团，如生物素和荧光基团等，后续的富集过程中与链霉亲和素珠等特异性结合。活性探针优先考虑了药物活性，但也有着体积大和内源性生物素化蛋白可能使结果产生假阳性等缺点。

图4 活性探针靶点筛选原理示意图

（3）点击化学探针。即在天然产物上引入一个炔基，通过炔基和叠氮之间的点击化学反应，可以合成共价连接的探针，最终实现下游靶点蛋白的筛选。这种探针体积相对较小，在药理活性影响很小，且药物分子在点击反应前可以很容易地到达细胞质原位结合靶蛋白，更能反应真实的药物作用机理。

图5 点击探针靶点筛选原理示意图

（4）光亲和探针。即有点击化学探针和一个光亲和基团如二苯甲酮、双吖丙啶等组成。后续流程与点击化学探针类似，光亲和探针基团在特定波长光的照射下会产生高活性自由基，促使活性分子与靶标共价结合，弥补了点击化学探针在活性分子靶标结合不稳定时的应用局限性。

图6 光亲和探针靶点筛选原理示意图

第一种靶点筛选的方法是凝胶分离和条带鉴定。即用探针对目标靶点蛋白进行富集，然后通过SDS-PAGE或二维电泳进行分离，使用考马斯亮蓝染色或银染后切胶回收，最后进行质谱分析，以此来鉴定靶点蛋白。尽管该方法已被广泛应用于蛋白质鉴定，但对于一些低丰度蛋白检测效果不佳，且鉴定准确性受靶标分离效果影响。

图7 凝胶分离和条带鉴定法原理示意图

第二种是定量蛋白质组学方法，分为体内标记的稳定同位素法（SILAC）和体外标记的相对定量同位素法（iTRAQ）两类。SILAC是指将探针与同位素标记的细胞裂解液共孵育，同时将阴性对照与正常细胞裂解液共孵育，并汇集两者靶标共同进行质谱分析。通过比较两组之间的相对蛋白质丰度，鉴别出特定的靶点蛋白。iTRAQ可用于对蛋白质消化后的肽段进行稳定同位素标记，并利用标记试剂对MS/MS片段中的报告离子进行定量，由于不同iTRAQ试剂中报告离子的质量差异，可以计算出不同组别蛋白质的相对丰度。

图8 定量蛋白质组学原理示意图

第三种靶点筛选的方法是蛋白质微阵列。例如HuProt 20K人类蛋白质组芯片（welcome-球速体育可提供此芯片靶点筛选服务），将体外纯化表达的蛋白固定在一张芯片上，然后用生物素标记的化合物与20K芯片共同孵育，利用CY3或CY5标记示踪，即可确定小分子的直接结合靶蛋白。该方法最大优点是高通量，可以一次性识别整个蛋白质组中的靶点蛋白。虽然是体外结合，但鉴定到的是直接结合靶点。基于众多优势，20K人类蛋白质组芯片已经广泛应用在药物靶点研究中。

图9 蛋白质微阵列原理示意图

最后一种是非标记法靶点筛选的方法。例如药物亲和力反应靶点稳定性（DARTS）、氧化率蛋白质稳定性（SPROX）、细胞热转移分析（CETSA）等。

该方法用质谱对蛋白进行分析，通过比较小分子存在和不存在时的差异蛋白来确定化合物的靶点蛋白。虽然非标记法应用广泛，但也存在结合原理的限制。

图10 非标记法原理示意图

天然产物靶点鉴定一直是机制研究中的重点，随着化学生物学和蛋白质组学的发展，天然药物靶点筛选的方法在日益更新，化学蛋白质组学方法的使用将继续推动全新治疗性天然化合物的发现。

中药物质基础研究及小分子药物靶点发现一直是达吉特专注的科学领域，我们希望达吉特能为越来越多的中药及复方走向全世界的过程中提供有价值的技术支持。

达吉特针对于中药及小分子药物研究，建立了一套完整的技术服务体系：

1）中药/复方的有效成分高精度鉴定；

2）中药有效成分与代谢物组织空间分布

3）小分子化合物批量标记（生物素/炔基/荧光）

4）小分子钓靶（标记法）：20K人类蛋白组芯片/ ABPP

5）小分子钓靶（非标记法）：DARTS /Lip-MS/ CETSA

6）膜蛋白靶点筛选技术：SPIDER / MPA

7）药物调控通路筛选：磷酸化抗体芯片/磷酸化蛋白组

8）SPR表面等离子共振（分子动力学）

9) 药-靶结合位点分析（高分辨质谱/分子对接）

10) PET-CT与药物分布小动物活体成像

11）天然产物化合物库筛选