在肿瘤治疗和研究领域，肿瘤微环境的免疫特性逐渐受到重视，尤其是肿瘤内部和周围的三级淋巴结构（TLS）形成及其对免疫反应的调控作用。近年来的研究表明，TLS与多种实体肿瘤的免疫治疗反应和患者生存率密切相关。探究TLS在肿瘤微环境中的作用机制，是开发治疗靶点的新思路。

近期来自中山大学附属第一医院的团队在《Cancer Cell》发表了题为“CCL19-producing fibroblasts promote tertiary lymphoid structure formation enhancing anti-tumor IgG response in colorectal cancer liver metastasis”的研究。本研究采用了单细胞测序、空间转录组、多重免疫组化等技术发现了一种分泌CCL19的成纤维细胞亚群，并且该亚群可以通过促进TLS的形成，抑制结直肠癌细胞侵袭和生长。

TLS在肿瘤免疫微环境中具有重要意义，研究人员通过HE染色对178名CRLM患者的肿瘤组织切片进行了HE染色，鉴定出902个TLS样结构。其中仅有少数TLS在肿瘤中，而多数TLS位于肿瘤周围（图1A-B）。在此研究人员通过评估患者肿瘤部位pTLS的数量和成熟度，将所有患者归类为TLS阳性（TLS+）和TLS阴性（TLS-）。结果显示TLS+患者在根治性手术后表现出比TLS-患者更好的生存期（图1C）。为了探究CRLM患者中TLS是如何形成的及其如何发挥功能，研究人员对CRLM患者的肿瘤和邻近肝组织进行了单细胞测序和单细胞B细胞受体测序（scRNA-seq和scBCR-seq）（图1D）。差异基因分析显示TLS+肿瘤相比TLS-肿瘤表达更高水平的免疫球蛋白基因，并且富集白细胞活化调节和抗原受体介导的信号通路（图1E-F）。浆细胞和B细胞在肿瘤和邻近肝脏位置的富集预示着两者的关键作用（图1G）。

图1 CRLM中TLS的重要作用

为了进一步探索CRLM患者中浆细胞的分类和分布，研究人员整合了scRNA-seq和BCR-seq的数据。结果显示IgG同种型主要在TLS+肿瘤中富集，而IgA同种型在TLS-肿瘤中普遍存在（图2A-B）。同时研究人员进行了多重免疫组化进行了TLS空间位置的分析，结果显示TLS附近有广泛的IgG+浆细胞存在，而IgA+浆细胞分散在非TLS区域。同时空间转录组得到了一致的结果（图2C-D）。为了进一步理解浆细胞在TLS附近的异质性，研究人员比较了在TLS+和TLS-CRLM中B细胞的发育，通过构建B细胞谱系的发育轨迹，研究人员发现了一条由IgG 浆细胞组成的分支，拟时序分析结果显示，TLS+肿瘤中B细胞倾向于转换为IgG同种型，TLS-肿瘤中的B细胞倾向于转换为IgA同种型（图2E）。

图2 TLS+肿瘤B细胞出现激活

为了证明在CRLM中TLS-PCs产生的抗体的肿瘤反应性，研究人员在体外生成了20个单克隆抗体（mAb），通过使用这些抗体在CRLM患者的肿瘤和癌旁组织进行染色，结果显示多数mAb对肿瘤组织的反应信号高于周围肝组织，这意味着肿瘤TLS相关浆细胞可以原位表达肿瘤反应性抗体（图3A-B）。接下来研究人员在体外比较了TLS-PCs衍生mAb的功能，发现mAb6/mAb7/mAb9与癌细胞结合信号明显高于肝细胞，同时免疫染色的结果证实了两者的结合（图3C-D）。研究人员进一步分析了肿瘤反应性抗体对巨噬细胞功能的影响，结果显示mAb6/mAb7/mAb9增强了巨噬细胞的吞噬作用，同时mAb6处理2周显著抑制小鼠肿瘤生长（图3E-F）。

图3 TLS-PCs产生具有抗肿瘤活性抗体

CRLM患者中B细胞的激活以及相关抗体的抗肿瘤活性已经明确，为了进一步了解B细胞在CRLM患者中的趋化性，研究人员检测了趋化因子受体在B细胞上的表达。其中CCR7+ B细胞在TLS+的肿瘤中富集，而TLS-肿瘤中B细胞表达低水平的CCR7。通过Cellchat分析细胞互作发现来自癌症相关成纤维细胞（CAF）的CCL19-CCR7轴仅在TLS+肿瘤和肝组织中观察到，TLS-肿瘤中则没有（图4A-B）。这预示着CCL19-CCR7轴可能作为B细胞募集的关键。为了探究成纤维细胞在TLS中的作用，研究人员分析了scRNA-seq数据，将成纤维细胞分为9个亚群，其中第五个亚群的CCL19+CAF在TLS+肿瘤和肝组织中富集（图4C），最后研究人员使用了mIHC来确定CCR7+ B细胞和CCL19+成纤维细胞的空间关系，两者邻近的空间距离也证实了成纤维细胞的募集作用（图4D）。

图4 成纤维细胞通过CCL19-CCR7轴募集B细胞

后续为了确定CCL19在抗肿瘤中的作用，研究人员利用CCL19或者CCL19联合抗CCR7的方法处理荷瘤小鼠。CCL19联合抗CCR7处理的小鼠显示出了更弱的B细胞募集能力以及更多的肿瘤负荷（图5A-B），这预示着CCL19的抗肿瘤作用依赖于CCR7。此外研究人员发现CCL19的单独处理并不会诱导TLS的形成，因此研究人员引入了淋巴组织中常见的趋化因子—CXCL13，在CCL19和CXCL13联合处理的小鼠体内显示出更明显的TLS形成和肿瘤抑制（图5C-D）。最后通过结合CRLM患者的临床数据，研究人员发现CCL19高表达与患者更好的生存相关，这预示着CCL19是CRLM患者中有价值的预测因子（图5E-G）。

图5 CCL19在临床预测中的作用

本研究描绘了结直肠癌肝转移（CRLM）中三级淋巴结构（TLSs）的分布特征，及其在肿瘤免疫中的重要作用。空间组学不仅描绘了多种抗体类型在肿瘤组织中的分布，还精准定位了CCL19+成纤维细胞和CCR7+ B细胞，确定了B细胞招募和TLS形成的细胞机制。最终研究人员结合临床数据确定了潜在的临床标志物—CCL19。空间组学的应用为揭示肿瘤微环境中复杂的细胞相互作用提供了关键视角，

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